第四章　工业菌种育种技术

【知识目标】

（1）理解和掌握无菌操作技术，工业上常用细菌、放线菌、霉菌和酵母的形态特征及应用，细菌革兰染色的原理和方法，光学显微镜和摇床的工作原理和技术特点，培养基的配制原则和种类，菌种生长的规律以及影响菌种生长的因素。

（2）了解工业微生物菌种选育的途径和方法。

（3）掌握根霉、毛霉、曲霉、青霉等主要霉菌的菌种衰退原因及防止措施。

（4）理解工业微生物诱变育种的原理。

【能力目标】

（1）熟练掌握微生物无菌操作规程。

（2）正确使用光学显微镜、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、干燥箱、超净工作台、摇床、种子罐等与细菌选育和培养有关的仪器和设备。

（3）熟练掌握无菌操作技术、培养基制备技术、消毒灭菌技术、分离纯培养和接种技术、染色技术等微生物基本操作技能。

（4）掌握自然界分离筛选和诱变选育菌种的方法技术。

（5）熟悉掌握工业生产菌种的孢子制备和种子制备技术。

（6）掌握利用亚硝酸诱变选育酵母营养缺陷型突变体技术。

（7）能熟练分析和解决酵母菌孢子和种子异常的问题。

第一节　工业常用微生物

自然界中存在着各种各样的微生物，它们具有不同的形态结构和生理特征，可以分成不同的类群。其中，细菌、放线菌、酵母和霉菌等已广泛应用于发酵工业，有的直接利用其菌体细胞，有的则利用其代谢产物或转化机能。了解微生物的种类、形态及生理特征的目的在于认识微生物的特性，掌握其生命活动规律，使其在工业生产中充分发挥作用。

微生物具有体积小、种类多、分布广、繁殖快、便于培养和容易发生变异等特点，并且在生产中不易受时间、季节、地区的限制，所以在工业生产上越来越广泛地被重视和应用。如前所述，发酵工程是以微生物的生命活动为中心的，各种发酵生产都必须有相应的微生物。微生物的生物学性状和发酵条件决定了其相应产物的生成。

工业上用的全部微生物都称为工业微生物。此外还要和杂菌污染打交道，杂菌污染会严重影响甚至完全破坏我们所需的工业发酵过程。此外，有些微生物既是工业生产菌，又可能是杂菌。例如，醋酸菌在生产醋时是生产菌，但会引起酒类的败坏。工业生产上常用的微生物和经常遇到的杂菌主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。由于发酵工程本身的发展以及基因工程正在进入发酵过程，病毒、藻类等其他微生物也正在逐步地变为工业生产菌。下面主要介绍与发酵工程有关的主要细菌、放线菌、霉菌和酵母类群。

一、细菌

细菌是自然界中分布最广、数量最多的一类微生物，属单细胞原核生物，具有较典型的核分裂或二分裂繁殖。体型微小，通常在1000倍的光学显微镜成电子显微镜下才能看到。

工业生产常用的细菌有以下几种。

1.枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌为芽孢杆菌属的一种需氧菌。营养细胞杆状，大小一般为（0.7～0.8）μm×（2～3）μm。菌端半圆形。单个或呈短链。在菌体中央或稍偏形成芽孢，芽孢为椭圆形或柱状，大小为（0.6～0.7）μm×（1.0～1.5）μm，芽孢形成后菌体不膨大。细胞侧生鞭毛，能运动。革兰染色阳性。生长温度为30～39℃，但在50～56℃时尚能生长。最适pH值为6.7～7.2。芽孢耐高温，一般在100℃，3h才能杀死。有的芽孢抗高温能力更强，在100℃煮沸8h尚能发育生长，故需高温灭菌才行。它能在铵盐液体中发酵各种糖类生成酸。

由于芽孢能耐高温，所以分布较广，常存于枯草和土壤中。一般来说为腐败菌，如在酱油、酱类和白酒制曲时，如果水分含量大，温度较高，就容易造成枯草杆菌迅速繁殖。这不但消耗原料蛋白质和淀粉，而且生成刺眼鼻的氨味，造成曲发黏和异臭，使制曲失败。经科研获得的枯草杆菌能产生大量的淀粉酶和蛋白酶，这些已分离到的优良菌种在工业生产上得到了广泛应用。例如，AS1.393枯草芽孢杆菌用于生产中性蛋白酶，发酵生产酱油、食醋及饴糖时就可采用BF7658枯草芽孢杆菌生产的α-淀粉酶。

2.大肠杆菌

细胞长度为0.5μm×（1.0～3.0）μm，有的近似球状，有的则为长杆状。革兰染色阴性。能运动或不运动，运动者周生鞭毛。许多小种产生荚膜或微荚膜，无芽孢。

大肠杆菌发酵乳糖，产酸、产气。大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸定量分析。还可以利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。在医药方面和基因工程方面，大肠杆菌是很好的研究材料。

3.乳酸杆菌

细胞杆状到球状。常生长成链，大多不运动，能运动者为周生鞭毛。革兰染色阳性。无芽孢。正常菌落粗糙。发酵碳水化合物，产物的85％以上为乳酸。厌氧或兼性厌氧。生长温度为45～50℃。

常用的德氏乳酸杆菌为杆状，大小为（0.5～0.8）μm×2.9μm。在麦芽汁糖化液内繁殖特别旺盛。菌体肥壮，产酸力特别强。在固体培养基上，菌落微小。在肉汁培养基内略带混浊。

由于乳酸菌能产生乳酸，所以可用于食品的保存和调整食品的风味。在食品工业上如干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜等制作无不与乳酸菌有关。在酱油酿造过程中，它也起到了良好的作用。

4.丙酮丁醇梭菌

细胞呈杆状，圆端，（0.6～0.7）μm×（2.6～4.7）μm，芽孢囊（1.3～1.6）μm×（4.7～5.5）μm。单生或成对，但不成链。芽孢卵圆，中生或次端生，使芽孢囊膨大成梭状或鼓槌状。无荚膜。以周毛运动。有淀粉粒。革兰染色阳性，可能变为阴性。专性厌氧菌。在葡萄糖琼脂上形成圆形紧密隆起的菌落，乳脂色，不透明，液化明胶。能发酵多种糖类，包括淀粉、糊精等。

生产上多用来生产丙酮丁醇。发酵适温30～32℃，生长适温37℃，最适pH值6.0～7.0。

5.肠膜状串珠菌

细胞呈球状或双凸镜状，大小（0.5～0.7）μm×（0.7～1.2）μm，成对或链，常排列成短链。革兰染色阳性，菌落小，灰白色，隆起，不液化明胶。能发酵多种糖产酸、产气。微需氧至兼性厌氧。生长需缬氨酸和谷氨酸。此菌在蔗糖液中形成特征性葡聚糖黏液，促使形成这一特征的温度是20～25℃。在厌氧条件下能分解葡萄糖。

此菌生长温度在10～37℃，适温为20～30℃。因其常使糖汁变黏而无法加工，故为糖厂的有害菌。但它却是葡聚糖的生产菌。

6.醋酸杆菌

细胞从椭圆形到杆状，（0.6～0.8）μm×（1.0～3.0）μm。有单个的、成对的，也有成链的。在老培养物中易呈多种畸形菌体，如丝状、梯状、弯曲等。鞭毛有两种类型，一种是周生鞭毛，另一种是端生鞭毛。不形成芽孢。

醋酸菌是化能异养菌，革兰染色阴性。因为没有芽孢，故对热抵抗力较弱。根据醋酸菌发育时对温度的要求和特性，可将醋酸菌分为两类：一类发育适温在30℃以上，以氧化酒精成醋酸为主的称为醋酸杆菌；另一类发育适温在30℃以下，氧化葡萄糖为葡萄糖酸的称为葡萄糖氧化杆菌。在醋酸杆菌中常用的有AS1.41，外形为短杆状，两端钝圆，革兰染色阴性。对培养基要求粗放，在米曲汁培养基中生长良好。好气性。氧化酒精为醋酸，于空气中使酒精变混浊。表面有薄膜，有醋酸味。也能氧化乙酸为CO2和H2O。繁殖适宜温度为3l℃，发酵温度一般为36～37℃。

7.棒状杆菌

细胞呈杆状，直形或微弯。常呈一端膨大的棒状，折断分裂，成“八”字形排列或栅状排列。不运动，仅少数致病菌能运动，无芽孢。革兰染色阳性，也有些阴性反应者。菌体内着色不均匀，好氧或厌氧。

调味品生产中，如谷氨酸生产常用的菌种有北京棒状杆菌。其细胞通常为短杆状至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝。呈多形态，即培养6h后细胞有延长现象。细胞排列为单个、成对或“八”字形。细胞大小为（0.7～0.9）μm×（1.0～2.5）μm。在26～37℃培养时生长良好，41℃时生长较弱。pH值5～10均能生长，最适pH值为6～7.5。生物素是必需的生长因素，硫胺素或某些氨基酸有促进生长的作用。能利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖等产酸，但均不产气。通气培养在含葡萄糖和尿素或铵盐的适宜培养基中，能大量积累L-谷氨酸。

8.短杆菌

细胞为短而不分枝的直杆状，一般在（0.5～1.0）μm×（1.0～5）μm，大多数不具鞭毛。在肉汁蛋白胨培养基上生长良好。有时产生非水溶性色素，呈红色、橙红色、黄色、褐色。革兰染色阳性。不形成芽孢，为好氧微生物。多数从葡萄糖发酵产酸，不发酵乳糖。大多数液化明胶，还原石蕊。

此属菌有谷氨酸发酵能力，在利用糖质原料的谷氨酸发酵中，需要生物素作为生长因子，才能满足谷氨酸发酵。短杆菌属中的黄色短杆菌和硫殖短杆菌能用于谷氨酸发酵生产。

9.黄单胞菌

细胞直杆状；两端钝圆稍尖；大小为（0.4～0.7）μm×（1.2～1.5）μm。革兰染色阴性，无芽孢，极生鞭毛。在含蔗糖的琼脂平板上可形成圆形、边缘整齐、黏稠光滑的黄色菌落，液体培养形成黄色黏稠的胶状物——荚膜多糖，其黄色为一种非水溶性色素。

野油菜黄单胞菌在通气条件下，于pH值6.8～7.0、28～30℃时，能以淀粉做碳源发酵生产黄原胶。

二、放线菌

放线菌因其菌落呈放射状而得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在富含有机质的微碱性土壤中较多。大多腐生，少数寄生。它的最大经济价值在于能产生多种抗生素。从微生物中发现的抗生素，有60％以上是放线菌产生的，因此人们在抗生素发酵工业中，非常重视对放线菌的研究与运用。常用的放线菌有以下见种。

1.链霉菌属

链霉菌的基内菌丝和气生菌丝多分枝，无分隔，直径0.5～2μm。气生菌丝产生许多孢子串生的孢子链，孢子链长短不等。此属中不少菌种产生抗生素，这些抗生素约占各种微生物（包括放线菌）所产抗生素的50％以上。

（1）灰色链霉菌　在葡萄糖-硝酸盐培养基上生长时，菌落平而薄，初为白色，逐渐变为橄榄色。气生菌丝浓密，粉状，呈水绿色。发育适温37℃，生产链霉素温度为26.5～27.5℃。

（2）龟裂链霉菌　于1950年就发现此菌能产生氧四环素（也称土霉素）。菌丝白色，呈树枝状；孢子为灰白色，呈柱形；菌落为灰白色，其表面后期有皱褶，呈龟裂状。

（3）金霉素链霉菌　在PDA培养基上生长时，其基内菌丝能产生金黄色色素，但其气生菌丝无色，孢子初为白色，经5～7天培养后，则由棕灰色转变为灰黑色。因该菌所产生的抗生素为金霉素（氯四环素），故称金霉素链霉菌。如其培养基中的NaCl以NaBr代替时，则此链霉菌又可产生四环素。

（4）红霉素链霉菌　此菌生长扩展有不同规则的边缘，菌丝深入培养基内，初为白色，后变为微黄色，菌落周围白色乳状，气生菌丝细，有分支。最适温度25℃，产生红霉素。

2.小单孢菌属

小单孢菌与一般放线菌有不同之处。菌丝体纤细，0.3～0.6μm。有分支和分隔，不断裂。菌丝体长入培养基内，不形成气生菌丝，而在基内菌丝体上长出孢子梗，其顶端生一个球形、椭圆形或长圆形的孢子。大小为（1.0～1.5）μm×（0.9～1.2）μm。菌落致密，与培养基紧密结合在一起，表面凸起，多皱或光滑、疣状，平坦者较少。菌落常为黄橙色、红色、深褐色、黑色和蓝色。

这是产生抗生素较多的一个属。如绛红色小单孢菌和棘孢小单孢菌都能产生庆大霉素。

3.游动放线菌属

一般不形成气生菌丝，基内菌丝分支，直或卷曲，多数不分隔，直径0.2～2.0μm，孢囊在基内菌丝体上形成，大小为5～22μm，着生在孢囊梗上或菌丝上，孢囊梗直或有分支，在每支顶上有一至数十个孢囊。孢囊孢子在孢囊内盘曲或呈直行排列，成熟后分散为不规则排列。孢子呈球形（1～1.5μm），有时端生1～40根鞭毛，能运动。孢囊成熟后，孢囊孢子释放出来。有的菌种能形成分生孢子。

4.诺卡菌属

基内菌丝较链霉菌纤细，0.2～0.6μm，有横隔，一般无气生菌丝。基内菌丝培养十几个小时形成横隔，并断裂成杆状或球状孢子。菌落较小，其边缘多呈树根毛状。主要分布于土壤中。有些种能产生抗生素（如利福霉素等），也可用于石油脱蜡及污水净化中脱氰等。

5.链孢囊菌属

孢囊孢子无鞭毛，气生菌丝的孢子丝盘卷成球形孢囊。其孢囊有两层壁，外壁较厚，内壁系薄膜，孢囊内形成孢囊孢子。这类菌亦可产生不少抗生素，如可抑制细菌、病毒和肿瘤的多霉素等。

我国生产的创新霉素由济南游动放线菌新菌产生。密苏里游动放线菌能以木糖为诱导物，大量生产葡萄糖异构酶。

近年来不仅从放线菌中发现一些医药上使用的抗生素新品种，而且还进一步将放线菌所产生的抗生素开发应用到农牧业和食品工业上。如灰色链霉菌所产生的杀稻瘟菌素S，用于稻瘟病的防治；可可链霉菌所产生的多氧霉素，对水稻纹枯病、稻瘟病、小麦白粉病以及果木真菌均有良效。

三、霉菌

凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌统称为霉菌。霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。霉菌喜偏酸性环境。大多数为好氧性微生物。多腐生，少数寄生。工业上常用的霉菌有藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉；子囊菌纲的红曲霉；半知菌类的曲霉、青霉等。

1.根霉

根霉在自然界分布很广，是一种常见的霉菌。它对环境的适应性很强，生长极迅速。幼龄菌落为白色，棉絮状。中期为灰黑色。老熟后菌丝丛生，密布黑色小点，即孢子囊。菌丝无横隔，为单细胞真菌。

在培养基上生长时，由营养菌丝体产生弧形生长的匍匐菌丝，向四周蔓延。匍匐菌丝接触培养基处，分化成一丛假根。从假根着生处向上生出直立的孢子囊柄，其顶端膨大形成圆形的囊，称为孢子囊。囊内生有许多孢子。成熟后的孢子囊壁破裂，释放出孢子。

根霉在生命活动中分泌的淀粉酶，能将淀粉转化为糖。因此，根霉可作为常用的糖化菌种。我国民间酿制甜酒用的小曲主要含有根霉。由于根霉能分泌丰富的淀粉酶，而且又含有酒化酶，所以在生产中可边糖化边发酵。又因为根酶生长要求的温度较高，因而适于在高温季节使用。

根霉的应用十分广泛。目前常用的菌种有米根霉、华根霉、东京根霉和甘薯根霉。

（1）米根霉　米根霉的最适温度37℃，41℃时还能生长。米根霉的淀粉酶活力极强，多做糖化菌使用。也具有酒精发酵能力及蛋白质分解能力。大量存在于酒药与酒曲中。此菌由于耐高温，特别为在夏季生产豆腐乳提供了方便条件，解决了豆腐乳旧法生产只能在冬季进行的困难。

（2）华根霉　华根霉的最适温度为30℃。当发酵温度达45℃时，一般还能生长。此种菌淀粉液化力强，有溶胶性。能产生酒精、芳香脂类等物质。在酒药与酒曲中大量存在。它是酿酒所必需的主要霉菌，也是酸性蛋白酶和豆腐乳生产中的主要菌种。

2.毛霉

毛霉分布亦较广，在基质表面生成灰色、白色或黄褐色的棉絮状菌落。菌丝不分支，不具横膈膜，为多核单细胞真菌。菌丝发育成熟时，顶端产生圆形、柱形或犁头形囊轴，围绕囊轴形成圆形孢子囊。孢子囊梗有不分支、总状分支和假轴状分支三种类型。

毛霉多见于阴湿低温处，是制曲时常见的杂菌和可利用的菌，其中常见的有鲁氏毛霉，它最初是在我国小曲中分离出来的。此菌能产生蛋白酶和淀粉酶，有分解大豆蛋白的能力，可用来制作豆腐乳，也用于酒精的生产。总状毛霉，我国著名的四川豆豉即用此菌制成。高大毛霉，此菌分布较广，在牲畜粪便上或白酒厂阴湿的堆积发酵物上常可见到。它能产生脂肪酸、琥珀酸，对甾体化合物也有转化作用。

3.犁头霉

犁头霉的菌丝和根霉很相似，但犁头霉产生弓形的匍匐菌丝，并在弓形的匍匐菌丝上长出孢子梗，不与假根对生。孢子梗往往2～5支，成簇，很少单生，而且常呈轮状或不规则的分支。孢子囊顶生，多呈梨形。囊轴呈锥形、近球形等。孢子小而呈单孢。大多无色，无线状条纹。接合孢子生于匍匐菌丝上。

犁头霉分布在土壤、粪便和酒曲中，空气中也有它们的存在。常为生产的污染菌，其中有的是人畜的病原菌。

犁头霉对甾体化合物有较强的转化能力，如蓝色犁头霉能转化多种甾体。

4.曲霉

曲霉菌丝有横隔，菌丝体由多细胞菌丝所组成。营养菌丝匍匐生长于培养基表层。匍匐菌丝可以分化出厚壁的足细胞。在足细胞上生出直立的分生孢子梗，顶端膨大成顶囊，顶囊一般呈梯形、椭圆形、半球形或球形。在顶囊表面，以辐射状生出一层或两层小梗，称为初生小梗和次生小梗。在小梗上着生有一串串分生孢子。分生孢子具有各种形状、颜色和纹饰。

曲霉在发酵工业、医药工业、食品工业和粮食贮存等方面有着极重要的作用。几千年来我国民间就用曲霉酿酒、制酱、制醋等，应用十分广泛。

（1）米曲霉　米曲霉有较强的蛋白质分解能力，同时又具有糖化能力，所以很早就利用米曲霉来生产酱油和酱类。米曲霉在酿酒生产中被作为糖化菌，此外，它还是重要的蛋白酶和淀粉酶的生产菌。

（2）黄曲霉　培养温度37℃。黄曲霉产生液化型淀粉酶，并较黑曲霉强。蛋白质分解能力次于米曲霉。黄曲霉能分解DNA，产生5'-脱氧胞苷酸、5'-脱氧腺苷酸、5'-脱氧鸟苷酸和5'-脱氧胸腺嘧啶核苷酸。

黄曲霉中有些菌能产生黄曲霉毒素，引起家畜家禽中毒，以致死亡。这种黄曲霉毒素也是致癌物质。我国有关部门对使用过的黄曲霉进行过产毒试验。为了防止污染食品，保障人民身体健康，现已停止使用会产生黄曲霉毒素的菌种，改用不产毒素的菌种。

黄曲霉与米曲霉极为相似，容易混淆。因而除了观察菌落个体特征外，还要结合生理特性加以区别。米曲霉在含0.05％茴香醛的察氏培养基上，分生孢子呈现红色，而黄曲霉则无此反应。

（3）黑曲霉　黑曲霉具有多种活性强大的酶系，如淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和葡萄糖氧化酶等。还能产生多种有机酸，如抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖酸和没食子酸等，所以在工业上被广泛应用，是生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种。黑曲霉群中还包括有乌沙米曲霉（又名宇佐美曲霉）、邬氏曲霉、适于甘薯原料的甘薯曲霉，以及由乌沙米曲霉变异而来的白曲霉。一些白曲霉中较优良的菌种不仅能分泌较丰富的淀粉酶、果胶酶和纤维素酶，而且酶系较纯，酶活力较强，同时又较耐粗放培养。因此，为目前北方酒精厂及白酒厂所广泛采用。

（4）栖土曲霉　培养温度为32～34℃，含有较丰富的蛋白酶，为蛋白酶生产菌种。AS 3.942为中性蛋白酶生产菌。

5.青霉

青霉的菌丝与曲霉相似，有分隔，但无足细胞。其分生孢子梗的顶端不膨大，无顶囊。分生孢子梗经过多次分支，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚。小梗顶端产生成串的分生孢子。分生孢子一般为蓝绿色或灰绿色。

青霉的孢子耐热性较强，菌体繁殖温度较低，是制曲时常见的杂菌，对制曲危害较大。它使酒味发苦，同时对曲房等建筑物也有腐蚀作用，是酿酒上的有害菌。但有些青霉菌，不仅是生产青霉素的重要菌种，还被用来生产有机酸、维生素和酶制剂等。

（1）产黄青霉　产黄青霉能产生多种酶类及有机酸。在工业生产上主要用其变种来生产青霉素，也能用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸等。

（2）橘青霉　橘青霉可产脂肪酶、葡萄糖氧化酶和凝乳酶，有的菌系能产生5'-磷酸二酯酶，可用来分解核酸，生产5'-核苷酸。此菌分布普遍，在霉腐材料和贮存粮食上常发现生长。会引起病变，并具有毒性。

此外，还有娄地青霉，具有分解油脂和蛋白质的能力，可用于制造干酪。其菌丝含有多种氨基酸。其孢子能将甘油三酯氧化为甲基酮。展开青霉主要用于生产灰黄霉素。

6.木霉

木霉的菌丝生长初期为白色。菌丝在培养基上生长成平坦菌落。菌落生长迅速，棉絮状或致密层束状，表面有不同程度的绿色。菌丝透明，有隔，分支繁杂。分生孢子梗为菌丝的短侧枝，上有对生或互生分支。在分支上又可连续分支。分支末端为小梗，小梗上可生出瓶状、束状、对生、互生或单生等不同的分生孢子。依靠黏液，分生孢子在小梗上聚成球形或近球形的孢子头。分生孢子有球形、椭圆形、倒卵形等。壁光滑或粗糙，透明或亮绿色。

木霉在土壤中分布很广，在木材及其他物品上亦常能找到。有些菌株能分解纤维素和木质素等复杂的有机物。若能利用这一特性，以纤维素来代替淀粉原料进行发酵生产，这对国民经济将有十分重要的意义。但木霉也常造成蔬菜、谷物和大型真菌等的霉变，使木材、皮革及其他纤维性材料霉烂，给生产和生活造成一定危害。

7.紫红曲霉

紫红曲霉是红曲霉属的一种。菌丝具有不规则的分支。细胞内多核，含有橙红色的颗粒。直径3～7μm。菌丝和分支顶端产生分生孢子，单生或成短链。分生孢子呈球形或犁形。有性生殖时，在长短不一的梗上产生单一的原闭囊壳（子囊果）。渐渐成熟后，成为橙红色的闭囊壳，直径为25～75μm，闭囊壳内含有十多个球形子囊。每个子囊内又有8个光滑的卵圆形、无色或淡红色的子囊孢子，大小一般是（5～6.5）μm×（3.5～5）μm。紫红曲霉在麦芽汁琼脂培养基上生长良好。菌丝体最初为白色，后逐渐蔓延成膜状。老熟后菌落表面有皱褶和气生菌丝，呈紫红色，菌落背面也有同样的颜色。

紫红曲霉喜酸性环境，生长最适pH值为3.5～5.0，但即使在pH值2.5时也能生存。生长最适温度为32～35℃，有时达40℃也能生长。对酒精有极强的抵抗力。

紫红曲霉在我国民间早有利用，主要用作食品及饮料的着色剂，用红曲配制红酒、玫瑰醋、红腐乳以及其他食品。此外用它制成的红曲又可以做中药，有消食活血、健脾胃的功能。近年来，紫红曲霉还被用来生产糖化酶等酶制剂。

8.产黄头孢霉

菌丝分支，有隔，纤细，宽1～1.2μm，浅黄色；分生孢子梗短，不分支，无隔，微黄色；很少产生孢子。在籼米饭培养基上培养半月，可产生大量的不正常孢子，形态多样，单细胞或有一隔，直或弯曲，（5～12）μm×（2～4.2）μm。这种孢子壁较厚，可达0.5μm，可像分生孢子一样萌发繁殖。产生的头孢菌素C与青霉素一样同属β-内酰胺类抗生素，毒性极低，其衍生物称为先锋霉素。

四、酵母菌

酵母菌是单细胞真核微生物，在自然界中普遍存在，主要分布于含糖质较多的偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母较多地分布在油田周围的土壤中。酵母菌大多为腐生。生长最适温度为25～30℃。工业上常用的酵母菌有以下几种。

1.啤酒酵母

啤酒酵母是酵母属中应用较广泛的一个种。

在麦芽汁培养基上生长的啤酒酵母，其细胞为圆形、卵圆形或椭圆形。细胞单生、双生或成短串或成团。酵母细胞大型的（5～10）μm×（6～12）μm，小型的（3～9）μm×（4.5～10）μm。

细胞的长宽比为1～2。

根据啤酒酵母细胞长与宽的比例，可把它们分为三组。第一组酵母的细胞多为圆形、卵圆形，长宽比为1～2。这个组的酵母主要供生产啤酒、白酒和酒精以及面包用。第二组酵母的细胞大多是卵形或长卵形，长宽比为2。包括啤酒酵母的一些变种，如葡萄酒酵母等菌种，一般多供生产葡萄酒、果酒用。第三组酵母的细胞为长圆形，长宽比大于2。这组酵母耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用。

在麦芽汁琼脂培养基上，菌落为白色，有光泽、平坦、边缘整齐。在液体培养基中的生长有两类，工业上把发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面的酵母称为上面酵母；把易于凝集沉淀，发酵度较低的酵母称为下面酵母。

啤酒酵母的无性繁殖为芽殖，有性繁殖能形成子囊孢子。一般每个子囊内含有1～4个圆形、卵圆形的表面光滑的子囊孢子。

啤酒酵母能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及半乳糖，不能发酵乳糖及蜜二糖。对棉子糖只能发酵1/3左右。在氮源中能利用硫酸铵，不能利用硝酸钾。

啤酒酵母的应用范围十分广泛，常用于传统的发酵行业，如啤酒、白酒、果酒、酒精、药用酵母片以及制造面包等，所以又称为酿酒酵母。近几年来，还利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。由于酵母菌体内的维生素、蛋白质含量较高，食用安全，所以啤酒酵母作为一种单细胞蛋白（SCP）可做食用、药用和饲料用酵母。它的转化酶可用于转化蔗糖，制造酒心巧克力。在维生素的微生物法测定中，啤酒酵母常被用于测定生物素、泛酸、硫胺素、肌醇等的含量。

2.葡萄汁酵母

在麦芽汁中25℃培养3天，细胞圆形、卵形、椭圆形或腊肠形。在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，平滑、有光泽、边缘整齐。

能产生子囊孢子，每个子囊内有孢子1～4个。孢子呈圆形或椭圆形，表面光滑。此菌发酵能力甚强，在液体培养中常出现混浊现象。

葡萄汁酵母与啤酒酵母相似。主要的区别在于它能发酵棉子糖和蜜二糖。葡萄汁酵母也能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖。不能发酵乳糖。能利用硫酸铵，不能利用硝酸钾。葡萄汁酵母常用于啤酒酿造的底层发酵，也可食用、药用或做饲料。

3.汉逊酵母

此属酵母营养细胞的形态多样，为圆形、椭圆形、卵圆形、腊肠形不等。多边芽殖，有的种类能形成假菌丝。

子囊形状与营养细胞相同。子囊孢子1～4个，形状为帽形、土星形、圆形、半圆形，表面光滑。

异常汉逊酵母异常变种是汉逊酵母属中一个常见的种。细胞圆形，直径4～7μm。也有腊肠形的，为（2.5～6）μm×（4.5～20）μm。腊肠形中也有长达30μm者。多边芽殖，能由细胞直接形成子囊，每个子囊内有1～4个子囊孢子，但大多数为2个。子囊孢子礼帽形，由子囊内放出后常不散开。该变种生长在麦芽汁琼脂斜面上的菌落平坦，呈乳白色、无光泽，边缘丝状。在麦芽汁中培养后，液面有白色菌璞，培养液变混浊，底部有菌体沉淀。不能发酵乳糖及蜜二糖。对麦芽糖及半乳糖或弱发酵或不发酵。能同化硝酸盐，氧化烃类能力亦强，能利用煤油做碳源。

此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品香味，可用于酿酒和食品工业。但由于它们能利用酒精做碳源，又能在饮料表面产生干皱的菌璞，所以又是酒精生产的有害菌。

4.球拟酵母

球拟酵母的细胞为球形、卵形或略长形。多边出芽繁殖。

在麦芽汁斜面上菌落为乳白色，表面皱褶，无光泽，边缘整齐或不整齐。在液体培养基中有沉渣及酵母环出现，有时亦能产生菌璞。

此属酵母有一定的经济意义，有些种能产生不同比例的甘油、赤鲜醇、D-阿拉伯糖醇，有时还有甘露醇。在适宜条件下，能将40％葡萄糖转化成多元醇。还有的能产生有机酸、油脂等。有的能利用烃类生产蛋白质。

此属菌酒精发酵能力较弱，能产生乙酸乙酯（因菌种而异），增加白酒和酱油的风味。

5.假丝酵母

细胞圆形、卵形或长形，多边出芽繁殖，能形成假菌丝。在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，平滑，有光泽，边缘整齐或菌丝状。液体培养时能形成浮膜。

能发酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖。不能发酵麦芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖。不分解脂肪。能同化硝酸盐。

假丝酵母的蛋白质和B族维生素含量都比啤酒酵母高。它能以尿素和硝酸盐做氮源，在培养基中不加其他因子即可生长。它能利用造纸工业中的亚硫酸废液，也能利用糖蜜、马铃薯淀粉和木材水解液等。因此能利用假丝酵母来处理工业和农副产品加工业的废弃物生产可食用的蛋白质，在综合利用中很有价值。此属中有的菌能转化50％的糖成为甘油。

假丝酵母也是脂肪酶的生产菌种，在工业上可用于绢纺原料的脱脂。

6.毕赤酵母

细胞为椭圆形、长椭圆形或腊肠形，单个或成短链。异形接合形成子囊孢子。子囊孢子椭圆形。在麦芽汁琼脂上菌落为乳白色，无光泽，边缘有细缺口。在麦芽汁中培养，培养液表面有白而皱的粗糙的菌璞，底内有菌体沉淀。

此菌分解糖的能力弱，不产生酒精。能氧化酒精，能耐高或较高浓度酒精。常使酒类和酱油产生白花，形成浮膜，为酿造工业中的有害菌，如粉状毕赤酵母。

7.红酵母

细胞圆形、卵形或长形。多边芽殖，有明显的红色或黄色色素。很多种因由荚膜而形成黏质状菌落。本属中有较好产脂肪的菌种，可由菌体提取大量脂肪。有的种对烃类有弱氧化作用，并能合成β-胡萝卜素。如黏红酵母黏红变种能氧化烷烃生产脂肪，含量可达干生物量的50％～60％。在一定条件下还能产生α-丙氨酸和谷氨酸，产蛋氨酸的能力也很强，可达干生物量的1％。

8.棉病针孢酵母

棉病针孢酵母又名棉病囊霉。在麦芽汁和马铃薯培养基上26℃培养良好。开始时湿润的匍匐菌丝蔓延生长，菌落无色或灰白色，2～3天后渐趋淡黄色，5天后呈柠橙黄色，7～10天后菌落周围的培养基因核黄素的扩散而呈黄绿色。生物素是促进该菌生长的重要因素，甘氨酸对核黄素的产生有促进作用。曾有人报道，用猪油或玉米油可以代替所有碳源培养该菌，且生长良好；棉病囊霉能危害许多重要的经济作物，如棉花、柑橘、番茄等。最早是从染病的棉桃上分离而来的。该菌具有大量合成核黄素的能力，产量可达4187μg/mL，因此它是核黄素生产的重要菌种。

9.白地霉

白地霉是地霉属中常见的一个种。裂殖，节孢子单个或连接成链，长筒形、方形，也有椭圆形的，末端钝圆。节孢子绝大多数为（4.9～9.6）μm×（5.4～16.6）μm。

在麦芽汁中，28～30℃培养一天，生白色璞。毛绒状或粉状，韧或易碎，为真菌丝。生长温度33～37℃。对葡萄糖、甘露糖、果糖等发酵较弱。能同化甘油、乙醇、山梨醇、甘露醇。能分解果胶、油脂等。不同化硝酸盐。菌体细胞含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和大量的核酸。它具有适应性强、生长快、产量大、培养方法简单等特点。

白地霉菌体的蛋白质营养价值很高，可供食用和饲料用，也可用来提取核酸，在废料废水的综合利用上很有价值。在制曲中，白地霉的污染会降低糖化能力，直接影响出酒率，所以它是白酒生产中的有害菌。

第二节　育种的遗传学基础

遗传是指经由基因的传递，使后代获得亲代的特征。变异是指生物体子代与亲代之间有差异，子代个体之间有差异的现象。遗传和变异均是生物体的属性。变异分两大类，即可遗传变异与不可遗传变异。现代遗传学表明，不可遗传变异与进化无关，与进化有关的是可遗传变异，前者是由于环境变化而造成，不会遗传给后代，如由于营养条件不足而造成的生物体瘦弱矮小、发育不良等；后一变异是由于遗传物质的改变所致，其方式有突变（包括基因突变、染色体变异和质粒脱落等）与基因重组。遗传和变异是生物界的普遍规律，没有遗传则生物的特性就无法保持与传代；没有变异则生物就没有进化和发展。种瓜得瓜，种豆得豆，就形象地描述了生物的遗传性。微生物也和其他生物一样，在一定条件下，亲代总是把自身的形态特征和生理性质传给它的后代，同时，还会在不同程度上出现差异。下面主要介绍遗传物质的确定实验及存在方式。

一、典型实验

1.肺炎双球菌转化的小鼠实验

1869年瑞士青年科学家米歇尔（F.Miescher）由脓细胞分离得到细胞核，并从中提取出一种含磷量很高的酸性化合物，称为核素，虽然还没有肯定这就是生命的遗传物质，但这是由实验方法分离得到核酸的最早记录。1928年英国的细菌学家格里菲斯（Griffith）首先发现肺炎双球菌的转化现象。肺炎双球菌存在两种类型：能致死的光滑型（S）和不能致死的粗糙型（R）。选取小白鼠做实验对象，实验如下。

①在活的小鼠体内注射活的S型菌后小鼠死亡。

②在活的小鼠体内注射活的R型菌或热致死的S型菌后小鼠不死亡。

③在活的小鼠体内注射活的R型菌和热致死的S型菌后小鼠死亡。

④将活的R型菌和热致死的S型菌单独培养不能获得活的S型菌。

①、②两个实验只是验证了S型菌致死、R型菌不致死这两个条件，那么④表明③中导致小鼠死亡的原因在于活的R型菌和热致死的S型菌在混合生长过程中出现了转化并最终进行了表达，有活的S型菌产生，所以导致小鼠死亡。从以上实验中，我们只能得出一个结论：死的S型菌细胞中有某种或某几种成分转移至活的R型菌细胞中，并成功实现了转化、表达。

那么，这到底是哪些成分呢？我们继续做实验来解答疑惑。

1944年，O.T.Avery、C.M.Macleod和M.Mcarty从热致死的S型菌中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化实验（图4-1）。

由此，我们可以得出一个结论：只有S型细菌的DNA才能将双球菌的R型转化为S型。所以，我们可以说，死的S型菌细胞中有某种或某几种成分转移至活的R型菌细胞中并成功实现了转化、表达，这一成分即DNA。因此，DNA才是遗传物质。

2.植物病毒的重建实验

病毒只有内部的核酸和外部包裹的蛋白质外壳，成分最少，干扰也最少，因此，说服力也更强。1965年美国学者法朗克-康勒特（Fraenkel-Conrat）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）和另一株与TMV近似的霍氏车前花叶病毒（HRV）进行了植物病毒重建实验，如图4-2所示。

因此，病毒拆分重组后的表达结果只跟RNA有关系。

综合这两个实验，我们可以得出结论：核酸才是遗传物质，才能控制种的传递性。

二、遗传物质的存在方式

无论是原核生物、真核生物还是病毒，遗传物质的存在方式无外乎这么两种：染色体和质粒。

1.染色体

染色体是细胞内具有遗传性质的物体，易被碱性染料染成深色，所以叫染色体（染色质）。其本质是脱氧核甘酸，是能用碱性染料染色、有结构的线状体，是遗传物质基因的载体。

①同源染色体，即一个来自于母体，一个来自于父体的大小相似可以配对的染色体。

②异源染色体，即不是来自同个种的染色体（比如：大肠杆菌和啤酒酵母）。

③姐妹染色单体，即存在于染色体分裂间期到后期之间，由一个染色体复制而来的呈X型结合的两个染色体中的其中一个。

④单倍体，即具有配子染色体的细胞或个体，仅由一个基因组（对于原核生物来说，基因组就是它的整个染色体；对于二倍体的真核生物来说，基因组指能够维持其配子或配子体的正常生理功能的数目最低的一套染色体）所构成的个体（如细菌的芽孢）。

⑤多倍体，即体细胞中含有三个或三个以上基因组的个体，多倍体在生物界广泛存在，常见于高等植物（如三倍体无籽西瓜）中，由于基因组来源不同，可分为同源多倍体和异源多倍体。

⑥常染色体，即与性别无关的染色体（如人的22对常染色体）。

⑦性染色体，即与性别有关的染色体（如人的X染色体、Y染色体）。

2.质粒

质粒是细菌染色体以外的遗传物质，为闭合环状的双链DNA，存在于细胞质中，质粒主要编码细菌生命所非必需的某些生物学性状，如性菌毛、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代，也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。

质粒是真核细胞细胞核外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中的环状DNA分子。现在习惯上用来专指细菌（大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的染色体DNA以外的DNA分子。在现代生物学中质粒常被用作载体，如细菌接合操作中，F质粒（即性因子）充当DNA转移传递的载体。许多细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒（部分质粒为RNA）。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，卡那霉素抗性基因或四环素抗性基因等。有些质粒称为附加体，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。

目前，已发现有质粒的细菌有几百种，绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。细菌质粒的相对分子质量一般较小，为细菌染色体的0.5％～3％。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是4×107以上，较小一类的相对分子质量是1×107以下，少数质粒的相对分子质量介于两者之间。

细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10～200份拷贝，如果用一定的药物处理来抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒PBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。一般分子量较大的质粒属严紧型，分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

第三节　自然选育技术

常用的菌种选育方法见图4-3所示。

工业微生物菌种一般可以通过以下渠道获得：

①从微生物菌种保藏机构购买菌种；

②从自然界或现有菌种中分离筛选菌种；

③对筛选出的菌种进行改良从而获得新种。

从自然界中分离微生物菌种是最初获得工业微生物菌种的主要方式，从土壤中分离微生物菌种则是其中较为典型的分离方式之一。但土壤中微生物的种类繁杂，要想获得目标菌将要花费超大量的资金和时间。一些全球性大型微生物菌株研发公司的经验充分证实了这一点。据资料记载美国辉瑞制药有限公司为了筛选一个广谱抗生素，花费了数百万美元的资金；美国默沙东公司曾经通过分离研究一万株菌株才获得一株有用的微生物；美国礼来公司花了十年时间，从40万株微生物中发现了三个新抗生素生产菌株。由此可见，直接从自然界中通过分离的方式获得生产菌种显然是不经济的。

利用现有生产菌株，根据特定目标设计一种合理的筛选方法，淘汰不合目标特性的菌株，有可能在相对较短的时间获得有益于提高投资效益和生产能力的优良菌株。

例如1977年在单细胞菌体蛋白生产的研究中，研究人员就是利用现有菌株筛选获得了一株嗜热放线菌，他们确定的具体筛选目标如下。

①最适生长温度：55℃，可以节省冷却费用。

②蛋白质组成：甲硫氨酸含量较高，可作为饲料蛋白质的添加剂。

③菌体形态：丝状，可以简化从发酵液中获取菌体的过滤技术。

从自然界中直接分离筛选菌种的过程一般分为采样、增殖培养、纯种分离及纯培养、生产性能测定四个基本步骤。从现有菌种中分离筛选则可直接从分离开始进行。

现以从土壤中分离筛选细菌菌种为例，介绍分离筛选的主要步骤。

一、采样

1.选择采样地点

自然界中可用于工业生产的微生物样本是极其丰富的。土壤、水、植被、组织结构等都含有众多微生物。整体来看，土壤含菌量最多，是采集、分离菌种、菌株的最好介质。

一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多；中性偏碱的土壤以细菌、放线菌为主；酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多；果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌也较多。

2.确定采样时间

采样应充分考虑采样的季节性和时间因素，以温度适中，雨量不多的秋初为好。如在夏季或冬季土壤中微生物存活数量较少，暴雨后土壤中微生物也会显著减少。

3.采样

在合适的时间选好适当地点，用无菌刮铲、土样采集器等，采集有代表性的样品。具体采集土样时，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤自下向上层顺序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面50～150mm处的土。将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮纸袋或玻璃瓶中。采好的样品必须完整地标明样品的种类、采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等。采好的样品应及时处理，暂不能处理的应在4℃条件下贮存，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。

二、增殖培养

一般情况下，采来的样品可以直接进行分离。但为了扬长避短提高目标菌的数量，增加分离的概率，最好先进行增殖培养。进行增殖培养时可根据预定的技术措施和菌种特性，人为地加入一定的限制因素，以使所需的微生物增殖后在数量上占绝对优势。这些限制因素主要包括选择性的配制培养基（如营养成分、添加抑制剂等）和一定的培养条件（如培养温度、培养基酸碱度等）。

可以采用的方法如下。

1.控制培养基中碳源的种类

在选择碳源时根据微生物利用碳源的特点，可选定糖、淀粉、纤维素或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有能利用这种碳源的微生物才能大量正常生长，而其他微生物就可能死亡或被淘汰。

2.添加某些抑制或促进因子

在分离细菌时，培养基中添加浓度一般为50μg/mL的抗真菌剂（如放线菌酮和制霉素），可以抑制真菌生长。在分离放线菌时，通常于培养基中加入1～5mL天然浸出汁（植物、岩石、有机混合腐质等的浸出汁）作为最初分离的促进因子，由此可以分离出更多不同类型的放线菌。

在分离霉菌和酵母时，培养基中添加浓度一般为50μg/mL的抑菌剂（如抗生素），可以抑制细菌生长。

3.控制培养条件

在分离梭状芽孢杆菌时，可利用该菌的厌氧特性，控制为厌氧培养环境，这样好氧菌就不易生长而受到抑制，只有厌氧菌可以优势生长。分离霉菌和酵母时选择在适合真菌生长的培养条件均可，即25～28℃，3～5天。

三、纯种分离及纯培养

通过增殖培养，样品中的微生物还是处于混杂生长状态，因此还必须分离、纯化。常用的分离方法有稀释分离法、划线分离法和组织分离法。

1.稀释分离法

将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布接种于培养基平板上进行培养，待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。

2.划线分离法

要首先铺培养基平板，然后用接种针（接种环）挑取样品，在平板上划线。划线方法可用分步划线法或一次划线法，无论用哪种方法，基本原则是确保培养出单个菌落。

经过上述分离培养成功后，会在平板上出现很多单个菌落。通过菌落形态观察，选出符合目标菌特征的菌落进行纯培养。在进行纯培养操作时，要先取目标菌落的一半进一步进行菌种鉴定，如果符合要求则可将另一半菌落转移到试管斜面进行纯培养。

四、生产性能测定

这种从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶进行小型发酵试验，以求得到适合于工业生产用的菌种。如果所得到的野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求，仍可以保留作为菌种选育的出发菌株。

第四节　诱变选育技术

诱变育种是指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。诱变育种有极其重要的实践意义，当今发酵工业所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的突变株。不仅如此，诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个主要步骤。

一、诱变选育的一般步骤

1.选择出发菌种

出发菌种是指用于诱变的原始菌种。出发菌种可以是从自然界的土样或水样中分离出来的野生型菌种；也可以是生产中正在使用的菌种；还可以是从菌种保藏机构购买的。选择的原则是菌种要对诱变剂的敏感性强、变异幅度大、产量高。

2.同步培养

在诱变育种前，最好选用生理状态一致的单细胞或单孢子，并尽量使菌悬液中细胞达到同步生长，即处于同一生长周期。具体做法有两类，一类是通过环境条件来诱导同步性，例如变换温度、光线，或向处于稳定期的菌悬液中添加新鲜培养基；另一类是用物理方法将同步生长中的细胞挑选出来，例如将非同步的细菌培养液通过大小不同的微孔过滤器，从而将大小不同的细胞分开，分别取滤液培养，就可获得同步生长的细胞。

3.制备单细胞或单孢子菌悬液

为了使每个细胞都能均匀接触诱变剂，通常要将出发菌种先制成单细胞（或单孢子）菌浮液，再进行诱变处理。菌悬液一般用无菌生理盐水或缓冲溶液配制，特别是用化学诱变剂进行诱变处理时，使用缓冲溶液可以克服处理过程中pH值变化带来的干扰。菌悬液的细胞或孢子浓度一般可以控制在106～108个/mL，处理酵母菌或霉菌时控制在106～107个/mL，处理细菌或放线菌时控制在108个/mL。另外为保证诱变效果，还要注意菌悬液的分散度。可采用先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤，经过这样的处理分散度可以达到90％以上。

4.诱变处理

在实践中，选用哪种诱变剂、剂量大小、处理时间长短等，都要视具体情况和条件，并经过预备实验之后才能确定。

（1）诱变剂种类　诱变剂包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。物理诱变剂有紫外线、X射线、γ射线、快中子等。化学诱变剂有1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基亚硝基脲（NMU）、硫酸二乙酯（DES）和环氧乙烷等。生物诱变剂为噬菌体和基因诱变剂。目前常用的诱变剂主要有紫外线、硫酸二乙酯、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍和NMU等。后两种的诱变效果比较突出，被誉为“超诱变剂”。

（2）剂量　剂量一般指作用强度与作用时间的乘积。剂量的选择受处理条件、菌种情况、诱变剂种类等多种因素的影响。在育种实践中，常采用杀菌率作为各种诱变剂的相对剂量。要确定一个合适的剂量，通常要进行多次试验。在实际工作中，突变率往往随剂量的增高而提高，但达到一定程度后，再提高剂量反而会使突变率下降。根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的研究结果，发现正向突变较多地出现在偏低的剂量中，而负向突变则较多地出现于偏高的剂量中，还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。例如，过去在用紫外线做诱变剂时，常采用杀菌率为99％的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为30％～75％的剂量。具体诱变剂的使用见表4-1。

此外诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应，因而对育种有利。复合处理的方法包括两种或多种诱变剂的先后使用，同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂的同时使用等。

5.筛选变异菌株

菌种经诱变处理后会产生各种各样的突变类型，但其中绝大多数是负突变菌株。筛选的目标是通过尽可能少的工作，将诱变后可能出现的正突变菌株从大量的突变菌株中分离鉴定出来。要获得预定的突变类型主要靠科学的筛选方案和筛选方法，一般要采用初筛和复筛两个阶段进行筛选。

（1）初筛　初筛的目的是快速对单个菌落进行定性。一般通过平板稀释法获得单个菌落，再确定单个菌落是否为正突变型菌株。初筛的方法有两类。一类是快速定性法，即对平板稀释法获得的各个菌落进行有关性状的初步测定，从中选出具有优良性状的菌落。

例如，对抗生素产生菌来说，选出抑菌圈大的菌落；对于蛋白酶产生菌来说，选出透明圈大的菌落。此法快速、简便，结果直观性强。缺点是培养皿的培养条件与三角瓶、发酵罐的培养条件相差大，两者结果常不一致。

另一类则是与复筛相似的较为精准的定量法。

（2）复筛　复筛的目的是对初筛选后获得的菌株进行有关性状的精确定量。一般要在摇瓶或台式发酵罐中进行培养，经过精细的分析测定，得出准确的数据。

（3）菌种筛选实例　现以青霉素产生菌高产突变菌种的筛选为例加以说明。将经诱变处理的菌液按一定浓度稀释后，涂布在平板培养基上。培养后，将长出的单个菌落接种到斜面培养基上。经培养后，再将每一支斜面上的培养物分别接种摇瓶，经振荡培养后测它们的抗生素效价。这就是初筛。当初筛中所得到的突变株对照效价超过10％时，再进行复筛。复筛的过程与初筛基本相同，只是复筛时一般将每支斜面上的培养物分别接种到三个摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行1～3次。

（4）平皿快速检测法　为了缩短筛选周期，尽量减少不必要的工作，人们一直在不断探索既简单快速又比较准确的筛选方法。目前已经有一些比较成熟的简便筛选方法，例如利用变异株的平皿反应直接挑取高产变异株就是其中的一种。

平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。实际是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在平板上表现出的一些容易观察判断的生理效应，比如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等（图4-4）。

这些生理效应的大小，表示了变异菌株生产能力的高低。以这些生理效应的大小作为筛选的标志，从而直接将高产菌株从平皿培养物中挑选出来，以简化变异菌株的筛选工作。

常用的平皿快速检测方法如下。

①纸片培养显色法　此法是将指示剂直接掺入或喷洒入固体培养基中，由于菌种的生长繁殖而改变了指示剂所处的环境，因而在菌落周围形成了变色圈。这种方法适合于多种生理指标的测定，如淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）大小的测定，氨基酸显色圈（转印到滤纸上再用茚三酮显色）大小的测定，柠檬酸变色圈（用溴甲酚蓝做指示剂）大小的测定等。根据这些生理效应的大小来估计相应代谢产物的产量。下面以筛选柠檬酸产生菌为例加以说明：

将与培养皿大小一致的滤纸片浸入含有0.02％溴甲酚蓝指示剂的培养基中，再将滤纸片放在培养皿中，用牛津杯架空，中间放一小块浸有3％甘油的脱脂棉以保湿，用接种环将适当浓度的菌悬液接种到滤纸上，保温培养，培养后可在菌落周围见到因产酸而出现的变色圈。最后，根据变色圈与菌落直径的比值计算出该菌的产酸能力。

②透明圈法　此法是在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景，菌种生长繁殖并形成菌落的同时由于利用了此物质而形成了透明圈。

有人将产蛋白酶的酱油曲霉突变体用紫外线处理，使之再变异，然后在含酪素的琼脂培养基上使其长出菌落，利用菌落周围透明圈的大小，选出了优良高产菌株U34，该菌的产酶活力约为出发菌株的6倍。

③琼脂块培养法　此法是筛选抗生素产生菌较为理想的一种方法，具体做法是：将诱变后的孢子悬液涂布在琼脂平板上，29℃培养2天，待长出稀疏的小菌落后，用打孔器取出长有单菌落的琼脂小块，并把它整齐地放入灭过菌的空培养皿中，保持一定温湿度，在29℃继续培养4～5天，使其产生抗生素并分泌在琼脂块内，然后将这些琼脂块移置于铺有实验菌的大方盘内，在29℃培养17～18h，观察抑菌圈大小，选取抑菌圈大的转接于斜面培养基。

这种方法的特点是当菌种刚长出小菌落时便用打孔器将它们分别取出培养，在这种条件下，各琼脂块所含的养料和接触空气的面积基本相同，而且产生的代谢产物也无处扩散，所以用这种方法获得的数据与摇瓶培养十分相似，然而工作效率却大大提高了。

通过上述初筛、复筛后选出的高产稳定菌种，还必须经过小型或中型的投产试验，才能用于生产。

二、营养缺陷型突变菌株的筛选

营养缺陷型突变菌株不仅在生产中可直接作为发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。

1.常用的几个术语

为方便对营养缺陷型突变菌株筛选过程的介绍，首先解释与之相关的几个术语。

（1）营养缺陷型　是指某一野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。

（2）野生型　从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷型突变前的原始菌株。

（3）原养型　一般指营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。

（4）基本培养基（MM）　指仅能满足某种微生物的野生型菌株生长最低限度需要的合成培养基。

（5）补充培养基（SM）　指在基本培养基中添加某种营养物质，以满足该种营养缺陷型菌株生长需要的合成或半合成培养基。例如在MM中加入蛋白胨（其中含多种氨基酸）便可以用来培养各种氨基酸的缺陷型菌株；加入酵母浸膏（含多种B族维生素和核苷酸）便可以培养不同的维生素、嘌呤和嘧啶缺陷型菌株。

（6）完全培养基（CM）　指可以满足某种微生物所有营养缺陷型生长需要的天然或半合成培养基。

2.筛选过程

营养缺陷型突变株的筛选一般经过诱变处理、淘汰野生型、检出营养缺陷型、营养缺陷型鉴定等步骤，最终筛选出营养缺陷型菌株。

（1）淘汰野生型菌株（或称为浓缩缺陷型）　经诱变处理培养后的细胞中除包含营养缺陷型菌株外，仍含有大量野生型菌株。为便于筛选，必须将野生型细胞大量淘汰以浓缩营养缺陷型细胞。常用淘汰野生型细胞的方法有抗生素法和过滤法，这两种方法主要依据了野生型细胞和营养缺陷型细胞在MM上的生长特性而设计的。

①抗生素法　抗生素法的基本原理是野生型细胞能在基本培养基上生长繁殖，可选用某种抗生素将这些处于生长状态的细胞杀死，而留下不能生长的缺陷型细胞。

②过滤法　过滤法是使能在基本培养基上生长形成菌丝体的野生型留在滤膜上，不能生长的营养缺陷型孢子则能透过滤膜。

由此可见，缺陷型能否被浓缩，关键是细胞在MM中能否生长。为了准确地表现细胞性状，必须使细胞在浓缩前耗尽体内或体表的营养，故需用MM充分洗涤。

（2）营养缺陷型的检出　浓缩后得到的营养缺陷型比例虽明显提高，但不是每株都是营养缺陷型，还需进一步分离，常用的方法如下。

①逐个检出法　把浓缩的菌液（细胞或孢子）在CM上进行分离培养，然后将平板上出现的菌落逐个、同时点种到MM和CM上，经过一定时间培养后，凡是在MM上不能生长，而在CM上能生长的菌落，经重新复证后仍然如此，则这样的菌落便是营养缺陷型（图4-5）。

②夹层检出法　在培养皿底层先倒入一层MM，待凝固后，在其上面倒入一层稀释菌液与MM的混合物（凝固后可再倒入一层MM），培养后长出的菌落为野生型，在其上面再加上一层CM，经过培养后新出现的小菌落则多数是营养缺陷型。这种方法一般适用于细菌（图4-6）。

③限量补充培养基检出法　将经过浓缩的菌液接种在含有微量（0.6％或更少）蛋白胨的MM上培养，野生型菌株能够迅速生长成较大的菌落，而营养缺陷型菌株生长较慢，故长成小菌落从而得以检出。

④影印检出法　将已灭菌的丝绒布包在直径小于培养皿的小圆柱体上，这样便制成了一个类似印章的工具，它可使菌落位置不变地从一个培养皿移至另一个培养皿。具体操作方法是：把印章放在已长出菌落的平皿（完全培养基）上轻轻压一下（注意不要沾上培养基），然后轻轻地分别印在基本培养基和完全培养基上。经过培养后，在完全培养基上生长，而在基本培养基上不生长的菌落便是营养缺陷型。影印检出法是在细菌抗药性变异研究中发展起来的技术，目前已在放线菌、酵母菌等形成小菌落的微生物育种中广泛应用。因霉菌孢子容易飞散，故常引起误差（图4-7）。

（3）营养缺陷型的鉴定　营养缺陷型的种类很多，选出后需要鉴定。常用生长谱法，即在基本培养基中加入某种物质时，能生长的菌便是该种物质的缺陷型。其步骤是，首先鉴定需要哪一类生长因子，可用天然产物的混合物检测，其次鉴定具体因子。

①缺陷营养类别的确定　常用于确定营养缺陷型类别的天然混合物有：不含维生素的酪素水解物、氨基酸混合物或蛋白胨；水溶性维生素混合物；0.1％碱水解酵母核酸液等。检测方法可用滤纸法。取直径5mm的滤纸片分别沾取以上混合物溶液，放在已接菌的平皿上培养，只要在滤片周围长出菌，即可判断出此营养缺陷型的类别。

②缺陷营养因子的确定　缺陷营养因子可能是一种，也可能是两三种或更多。检测时可用上述滤纸法，也可用营养组分分组法，例如，在分析15种可能的营养因子时，可按表4-2的组合配成5种溶液。将分别沾有5组营养因子溶液的纸片放置于MM上，观察生长情况，根据表4-2营养因子的组合及其缺陷示意表中营养因子缺陷示意栏查出其营养缺陷因子，然后再通过单一因子复证以最终确定。

第五节　杂交育种技术

诱变育种具有操作简单、效果明显的优点，但也有缺点。长时间、连续的诱变容易使细胞产生“疲劳效应”，即造成细胞生活力低下、代谢失衡严重、对诱变剂不敏感等不良反应，可以采用杂交的方法改善这一缺憾。并且通过具有不同性质的菌株间的杂交，可以使遗传物质进行交换和重新组合，扩大变异基点，获得优良的后代菌株，总结遗传物质的转移和交换规律，丰富遗传学理论，并最终能够实现菌种的选育。

杂交育种指不同种群、不同基因型个体间进行杂交，并在其杂种后代中通过选择而育成纯种的方法。

一、杂交育种准备工作

1.亲本菌株的选择

原始亲本要求具备某一或某几项值得选择的优良性状，如生产能力强、抗菌性强、产孢能力强等，而且，用于杂交的两个亲本之间可以取长补短，最后得到的重组体应该是集合了两亲本优良性状的集合体，而不良性状能全部或部分排除。两亲本是否同宗则没有严格的要求，但是为了达到大的突变幅度，应选用亲株间遗传性状差异较大者进行实验；为了杂交后菌株能快速稳定投产，则应选用遗传性状差异较小者进行杂交。具体操作中选择原则应实事求是。

选定原始亲本后，需要制备出能够直接用于杂交的细胞群，即直接亲本。直接亲本间要求具有稳定的遗传标记及亲和力才能够用于杂交实验。为了使重组体的检出能够更加高效和快速，让直接亲本带上不同的遗传标记是十分重要的。一般杂交亲本用营养缺陷型或耐药性突变型等做遗传标记。除此之外，抗逆性，包括抗高温、高盐、高酸碱等也可作为遗传标记，但不如耐药性用得普遍和效果明显。

2.亲本的培养

主要涉及几种培养基，即培养细胞用培养基、重组体检出培养基和生产性能测定培养基。培养细胞用培养基主要有基本培养基（MM，营养成分单一，只能满足具备某种微生物的野生型菌种表型的菌种生长）、完全培养基（CM，添加有全部生长因子的基本培养基）和有限培养基（LM，专供异核体生长使用的培养基，由10％CM与90％ MM混合而成）。重组体检出培养基则除包括以上三种培养基外，还包括补充培养基（SM，又称鉴别培养基，通常在MM中加入已知的生长因子配制而成）。发酵培养基则用来测定杂交菌种的发酵能力。以上培养基在配制时，为了保证鉴定结果的准确性，通常对药品和仪器容器的要求较高，药品纯度为化学纯以上，器皿要严格清洗消毒，否则会使结果呈现假阳性。

3.营养缺陷型的遗传标记

这是一种应用比较成熟的遗传标记方法，通过人工诱变使两个直接亲本分别带上不同的营养缺陷型标记，这样待杂交结束后，混合菌分离在MM上培养时，只有重组体和少量的回复突变成野生型的菌能够生长，亲本不能生长，从而可以快速地将重组体筛选出来，减少工作量。再看抗性标记，抗性标记中耐药性用得较多，一般耐药性标记容易获得，通过在亲本细胞内植入耐药性质粒就能达到。

下面以营养缺陷型标记制备为例来介绍遗传标记的制备方法。

第一步，诱发非缺陷型细胞发生缺陷型突变。

诱发突变常采用诱变剂来进行，这一步操作同诱变育种差别不大，选取时掌握对细胞染色体的伤害不宜过大，且突变率要高的原则即可。

第二步，富集培养。

富集的目标菌株当然为已经发生营养缺陷型突变的菌株，可通过两个途径实现：一是减少野生型菌株；另一个方法是增加目的菌株。因为营养缺陷型菌株对营养的特殊要求及野生型菌株较强的适应性，通常采用减少野生型菌株的方式来富集目的菌株。

案例一：采用青霉素法，将混合菌液投入MM上，青霉素抑制生长中的野生型细胞细胞壁的合成，杀死大量的野生型细胞。营养缺陷型细胞因为得不到生长所需要的生长因子，所以数量不变，因此通过减少野生型细胞的比例，达到富集目的。

案例二：采用物理参数法，杀死对逆性环境敏感的野生型细胞。如高温，对细菌来说，芽孢比营养态细胞对高温的抵抗性要强得多，在对营养态细胞诱发突变后，使之形成芽孢，转接形成的芽孢群体于基础培养基上，使野生型芽孢萌发，通过高温（80℃左右）杀死绝大多数细胞，缺陷型芽孢因未萌发，对高温依然免疫，得以存活。

第三步，检出带有标记的菌株。

经富集培养后，野生型菌株的比例大幅度下降，有利于目的菌株的检出，为得到纯的目的微生物，需采用一定的方法将带有标记的缺陷型菌株检出，介绍如下。

①分区对比法　将混合菌液涂布在CM培养基上，待菌落长出，分别点接在由MM和CM制成的平板上，观察生长情况（图4-8），如果同一株菌在MM上不生长，而在CM上能够生长，则其可能是带有营养缺陷型遗传标记的目的菌株，进一步复证。

②影印对照法　将混合菌液涂布在CM培养基上（单菌落数量以小于80个/皿为宜），待菌落长出至成熟（称母皿），用灭菌滤纸或丝绒印模在母皿平板上轻轻一印，将相对位置固定的母皿菌落复制到空白MM培养基平板，培养后观察生长情况。凡在母皿上有菌落，而在MM培养基上没有菌落的，可能是营养缺陷型菌株，挑出进行复证，确认后，转接至CM空白斜面培养至成熟，保藏待用。

第四步，确认带标记菌株为双缺陷菌株。营养缺陷型标记分单缺陷、双缺陷和多缺陷。CM单缺陷标记菌株在等待杂交实验开展过程中由于存在自然回复突变或其他因素引起的回复突变，最好不要采用单缺陷的遗传标记；多缺陷遗传标记又对缺陷鉴定无形中增加工作量且不易控制，也不适合；因此，从实际操作来看，选用双缺陷营养标记为最佳。

二、杂交育种的步骤与分析

杂交育种的基本程序如下。

杂交育种的基本程序几乎涵盖了全部操作步骤，下面我们简要介绍一下杂交的基本步骤：首先，选取原始亲本即出发菌种（可参见诱变育种出发菌种的选取部分），选定之后，通过诱变使原始亲本被处理成带有遗传标记的直接亲本，直接亲本通过亲和力测定（或能提前确认有亲和力）后，一般采用直接混合培养的方法，使两亲本在混合培养过程中接触、融合和传递遗传物质并整合，培养后的混合液经稀释后直接涂布在分离筛选平板上筛选重组体，筛选过程参见筛选方案，将得到的菌种进行稳定性实验和生产能力的测定，都符合后，进行菌种鉴定并保藏。

下面，我们主要讨论混合杂交实验原理和重组体筛选方案的制订。

杂交方案的确定主要是确定杂交方法，常规杂交育种中，方法主要有转化、转导、接合、溶源转换和转染等。

1.转化

这几乎是通用的一种杂交育种方法，各种菌在条件允许的时候都会采用这种方式进行变异，主要指受体菌（感受态细胞）直接吸收了来自同源或异源的DNA片段（质粒和染色体DNA），通过交换，把它整合到自己的基因组中，再经复制就使自己变成一个转化子。

这种受体菌直接接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象就称转化或转化作用。

现已知感受态因子是一种胞外蛋白质，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，以让细胞表面的DNA受体显露出来，便于接合。如图4-9，转化可分为以下几个阶段。

第一，双链DNA片段与感受态受体菌细胞表面的特定位点结合。

第二，在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成片段。

第三，DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，相对分子质量小于5×105的DNA片段不能进入细胞。

第四，来自供体的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，形成一个杂合DNA区段。

第五，受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获得。细胞分裂后，一个是转化子，另一个细胞与原始受体菌一样。

2.转导

1952年N.D.津德和J.莱德伯格在研究鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhi-murium）的重组时发现了这一现象。他们将甲硫氨酸和组氨酸营养缺陷型菌株LT-2以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸营养缺陷型菌株LT-22分别加入一支U形管的两臂，管的中部用一个玻璃细菌滤片将两臂隔开。培养几小时后，发现在LT-22这一边有不需要任何氨基酸的原养型细菌出现。由于两臂之间是用细菌滤片隔开的，所以导致原养型出现的基因重组不是通过细菌接合，而是通过某种滤过因子将LT-2的基因传递给LT-22。通过对滤过因子的大小、质量、抗血清、热处理的失活速度和寄主范围方面的全面鉴定，证实它就是沙门菌的P22噬菌体。进一步的研究证明LT-2菌株在没有游离噬菌体存在的条件下偶尔能裂解并释放有感染力的噬菌体P22。这种特性称为溶源性，是一种相当稳定的遗传性状。凡能使细菌溶源化的噬菌体都称为温和噬菌体，以不活动的状态存在于细菌细胞中的温和噬菌体称为原噬菌体。原噬菌体在一定条件下可以进入营养生长状态而复制繁殖，并终于导致细胞裂解而释放出噬菌体。因此，可以对上述转导现象的过程作这样的推断：当在LT-2细胞中的P22原噬菌体进行DNA复制和繁殖时，它们的外壳蛋白偶尔会错误地将LT-2染色体的某些DNA片段（这上面有苯丙氨酸基因、酪氨酸基因和色氨酸基因）包装到噬菌体内。这种噬菌体在从LT-2细胞释放出来后可以通过滤片去感染LT-22细胞，由此导入的基因再经重组整合到LT-22的染色体上使LT-22原来的缺陷型变成原养型细菌。

以噬菌体为载体，把DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合使后者获得前者部分遗传性状的现象称为转导。获得新遗传性状的受体细胞就称为转导子。

以噬菌体为媒介，把供体菌的基因转移到受体菌内，导致后者基因改变的过程称为转导。当噬菌体在细菌中增殖并裂解细菌时，某些DNA噬菌体（称为普遍性转导噬菌体）可在罕见的情况下（105～107次包装中发生一次），将细菌的DNA误作为噬菌体本身的DNA包入头部蛋白衣壳内。当裂解细菌后，释放出来的噬菌体通过感染易感细菌则可将供体菌的DNA携带进入受体菌内。如发生重组则受体菌获得了噬菌体媒介转移的供体菌DNA片段。这一过程称为普遍性转导。质粒也有可能被包入衣壳进行转导。不具有转移装置的质粒依赖噬菌体媒介进行转移，转导可转移比转化更大片段的DNA，转移DNA的效率较转化为高。

只有温和噬菌体可进行局限性转导。当温和噬菌体进入溶源期时，则以前噬菌体形式整合于细菌染色体的一个部位。当其受激活或自发进入裂解期时，如果该噬菌体DNA在脱离细菌染色体时发生偏离，则仅为与前噬菌体邻近的细菌染色体DNA有可能被包装入噬菌体蛋白质衣壳内。因此，局限性转导噬菌体所携带的细菌基因只限于插入部位附近的基因。由于局限性转导噬菌体常缺少噬菌体正常所需的基因，因此常需要与野生型噬菌体共同感染宿主后，进入受体菌细胞，这样才能将携带的基因转移至受体菌，并获得该段基因所决定的新特性的表达。

3.接合

供体菌（雄）通过直接接触（依靠其性菌毛）受体菌（雌）的完整细胞而传递大段DNA（包括质粒）遗传信息的现象叫接合（图4-10）。前者传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状。把通过接合而获得新性状的受体细胞称为接合子。此类方式实现杂交的代表菌为细菌（以大肠杆菌为例，见图4-10）。部分细菌含有性因子（F因子），它的实质是一种质粒，存在于细胞质中，一般为游离状态，它是细菌实现杂交的关键因素，能促进供体和受体的接合及遗传物质的转移传递。含有游离态F因子的细胞称为雄性菌株（F+），细胞内含有（1～4个）游离的F因子，细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛，与F-相接触时，可通过性菌毛将F因子转移到F-细胞中，使之也变成F+菌株。F因子以很高的频率传递，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般并不被转移。

接合的一般过程如下。

①接合时F+细胞与F-细胞相遇，性菌毛与F-细胞表面发生吸附而形成接合管。

②F+细胞内，F因子的一条DNA单链在特定的位点上发生断裂。

③断裂后的单链逐步解开，同时以另一条留存的环状单链做模板，通过模板的滚动，一方面把解开的单链以5’端为先导通过性菌毛推入F-细胞中；另一方面，在供体细胞内以滚动的环状模板重新合成一条互补的环状单链，以取代传递到F-细胞中的那条单链。这种DNA复制机制称为滚环模型。

④在F-细胞中，以外来的供体DNA线状单链为模板合成一条互补单链，并随之恢复成环状双链F因子。

⑤至此，原来的F-菌株变成了F+菌株。原来的供体仍为F+菌株。

含有结合态F因子的细胞称为高频重组雄性菌株（Hfr），含有与染色体特定位点整合的F因子，因该菌株与F-接合后的重组频率比F+菌株高几百倍而得名。Hfr菌株与F-菌株接合时，Hfr染色体双链中的一条单链在F因子处发生断裂，F因子位于线状单链DNA的两端，整段单链线状染色体从5’端开始等速进入F-细胞。在没有外界干扰的情况下，全部转移过程的完成需要约120min。由于种种原因DNA转移过程常会发生中断，所以越是前端的基因进入F-细胞的机会越大。F因子位于线状DNA的末端，进入受体细胞的机会最小，故这种接合引起转性的频率最低，但可以出现各种重组子。

不含有F因子的细胞称为雌性菌株（F-），细胞中不含有F因子，细胞表面不具有有性纤毛。可以通过与F+、F-、Hfr菌株接合而接受供体菌的F因子、F-因子或Hfr菌株的部分或全部遗传信息，相应地可以转变成F+菌株、F-菌株或重组子。据估计，从自然界分离到的2000株E.coli中约有30％是F-菌株。

接合杂交必须发生在有F因子的细胞与没有F因子的细胞之间（图4-11）。

4.溶源转换

类似于温和噬菌体的生活史过程，即噬菌体吸附、侵入宿主细胞（即这里的受体细胞）后，其DNA整合进宿主细胞的染色体中，并随着宿主细胞的繁殖而繁殖，且可以稳定存在。同时，宿主细胞获得了针对同类噬菌体的免疫性，这就是受体细胞获得的新性状。

5.转染

转染指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标记的过程，是原核细胞中转化的同义词。

常规转染技术可分为两大类：一类是瞬时转染；一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24～72h内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统（如荧光蛋白、β-半乳糖苷酶等）来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低，但整合率高。外源DNA整合到染色体中的概率很小，大约有1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH，新霉素抗性基因）、潮霉素B磷酸转移酶（HPH）、胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例、细胞数量、培养及检测时间等。

转染大致分为两类：化学转染法和物理转染法。

（1）化学转染法　包括：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法。

①DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，DEAE-葡聚糖转染成功地应用于瞬时表达的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。

②磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法，因为试剂易取得，价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究。先将DNA和氯化钙混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降解。

③人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA、RNA和蛋白质。此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是，脂质体还可以介导DNA和RNA转入动物和人的体内，用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内，至于DNA是如何穿过核膜的，其机理目前还不十分清楚。

（2）物理转染法　包括：显微注射、电穿孔和基因枪等。

①显微注射虽然费力，但它是非常有效地将核酸导入细胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物，但却不适用于需要大量转染细胞的研究。

②电穿孔法常用来转染如植物原生质体这样的用常规方法不容易转染的细胞。电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。导入的效率与脉冲的强度和持续时间有关。

③基因枪依靠携带了核酸的高速粒子将核酸导入细胞内。

三、杂交育种的注意事项

杂交育种过程相对简单，但从实际的实验效果来看，重组率一般都不高，而且，获得新遗传性状个体的周期较长。所以，为了保障杂交的成功，我们仍有些地方需要注意，主要集中在以下几点：直接亲本中遗传标记的好坏（这主要看带有标记的直接亲本在直接亲本中占有的比例）；亲本最好是近亲配对，有利于产生高产菌株；混合培养过程中环境条件设定至最佳，摇瓶验证和扩大规模模拟生产时条件尽量一致等。

第六节　原生质体融合育种技术

常规杂交由于受到亲和力的限制，杂交反应受到一定程度的限制，难以推广。为此，在前人探索的基础上，得到了更加有效、容易推广的基因重组方式——原生质体融合育种。

细胞壁被酶解或突变脱落后，剩下原生质膜包裹着的球状体为原生质体，简单来说，就是没有细胞壁的细胞。与正常细胞相比，原生质体具备一些新的生理特征：没有细胞壁的包裹，细胞缺少形态的支撑结构，故而，所有细胞均呈球状，与含有细胞壁时的细胞形态无关；缺少细胞壁的支撑保护，环境中的大量小分子物质和具有诱变作用的成分得以顺利通过原生质膜，使细胞对外界环境因素的改变变得更加敏感；没有细胞壁的存在，物种的生物信号间便没有办法互相识别，破除了杂交亲本间对亲和力的要求，使得杂交应用范围更广。

原生质体融合育种一般包含六大步骤（图4-12）。

1.两亲本菌株的选择和遗传标记的制作

融合育种也是为了得到具备双亲本优良性状的子代菌株，一般情况下，应选用贮藏活化的正变株作为亲本，进行原生质体融合，通过遗传物质交换、重组、表达，使子代细胞获得优良性状的传承。但是，从实验结果来看，更应该注意选用亲本，最好应选存在较大遗传背景差异的近亲菌种，重组后，优势更明显。

类似于杂交育种的亲本选择要求，应用于原生质体融合的两亲本也应该带有遗传标记，这样有利于检出融合子。前面已经学过，通常选用营养缺陷型或耐药性作为亲本菌株的遗传标记，除此之外，不常用的还有一些，例如热敏型、色素等，都可以作为亲本的遗传标记。在实际应用中，要依据融合目的及实际情况进行适当选取。

2.原生质体的制备（高渗条件）

制备出大量高活力的原生质体是进行原生质体融合的基本条件和前提。制备过程主要包括以下几个步骤。

操作基本流程见图4-13。

（1）原生质体的分离　运用有效手段去除亲本细胞的细胞壁，使原生质体得以脱离释放，此过程为原生质体的分离。原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力。此手段包括机械法和酶法。见图4-14。

①机械法　其缺点明显：产量极低，应用的材料受限制，操作极费力。因此，目前此法基本不采用，这里不再赘述。

②酶法分离原生质体　经常规操作标记好直接亲本后，取年轻的菌体接入高渗溶液中，加入相关水解酶，在最佳条件下酶解细胞壁；酶解后，即可实现原生质体的分离（图4-14）。该法克服了机械法分离的缺陷，可以在短时间内获得大量的原生质体，但酶制剂中的杂质可能会对原生质体产生一定程度的危害。

同培养微生物需要营养、控制培养物理参数等条件类似，要想获得活的微生物原生质体细胞，必须要为其提供最佳的操作条件，包括培养基选取、菌体的培养方式、菌龄、稳定剂、预处理、酶的种类及浓度选取、环境条件等因素。

（2）原生质体的收集　酶解后，释放的原生质体、未酶解的菌体及细胞壁的碎片混合液经无菌过滤介质过滤后，除去大部分的碎片和菌丝，低速离心后弃去上清液，收集沉淀。

（3）原生质体的洗涤　转接沉淀于同一种高渗溶液中，均匀打散，经低速离心后，转接至同一高渗溶液中。洗涤几次可以达到满意的效果。要根据实际情况来定，次数不能过多，过多容易引起原生质体的破裂。

（4）原生质体的纯化　采用上浮法和下沉法两种纯化方法。上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23％左右）混合，下沉法是先将原生质体与13％的甘露醇混合，然后加到23％的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。两种方法中，均在100r/min下离心5～10min，会在蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。用吸管将带轻轻地吸出来，用培养基悬浮离心，然后稀释到104～105/mL，用于培养和活力测定。

（5）原生质体的活力测定　原生质体培养前通常要进行活力检查，以便知道其状态是否正常。测定原生质体活力的方法主要有观察胞质环流、测定呼吸强度和荧光素双乙酸酯（FDA）染色，其中最常用的是FDA法。常将丙酮配制成2mg/mL溶液，在冰箱（4℃）中保存。FDA本身没有极性，无荧光，可以穿过细胞膜自由出入细胞，在细胞中不能积累。在活细胞中，FDA经酯酶分解为荧光素，后者为具有荧光的极性物质，不能自由出入细胞膜，从而在细胞中积累，在紫外光照射下，发出绿色荧光；相反，如果是死细胞，则不会发出绿色荧光。

（6）原生质体的保存　原生质体制备成功后，一般立即进行融合，不保存。如果不立即融合，则必须保存在低温条件下。通常采用液氮超低温保藏法进行保藏。

3.原生质体再生

原生质体含有细胞的全部遗传物质，但其本身不能进行正常的增殖，必须恢复到完整的细胞形态（也就是重新生成细胞壁）才可以。此过程大致分三步：第一步，原生质体会生长，细胞也要调动各种酶类和成分合成细胞器的组成大分子物质；第二步，合成生成细胞壁，包括细胞壁组成大分子的合成、组装与恢复；第三步即是完整细胞的分裂繁殖、生长和特征再现。

影响原生质体再生的因素有很多，主要都是此过程中涉及的方方面面，首要因素是原生质体本身的特性，这决定了其再生能力的大小。其他因素如下。

①菌体的生理状态。细胞要处于活化状态，年轻菌再生能力要相对强一些。

②稳定剂的选取加入。原生质体没有细胞壁的保护，要想存活必须生活在高渗溶液中，否则容易破裂，稳定剂的种类有糖系统、醇系统和无机盐系统。前两者主要应用于细菌、放线菌和酵母菌，后者主要用于霉菌。

③作用酶的浓度和时间。酶的浓度不宜过大，作用时间也不宜过长。

④原生质体再生时的密度。密度过大，因为生长争营养、争空间的缘故，先生长起来的会抑制后生长起来的。

⑤再生方法。因为原生质体没有细胞壁的支撑保护，不能够抵抗高强度的涂布摩擦，所以不能用玻璃涂布器，否则易于破裂。一般采用类似噬菌体检验时的噬菌斑夹层法。

另外，培养基的组成等也是很重要的影响因素，在操作时要注意。

4.融合

原生质体的融合一般可以采用以下几种方法来进行。

（1）化学法——PEG结合高Ca2+、pH诱导法　亲本原生质体制备好后，即可进行融合。在自然条件下融合概率极低，所以要人为促进融合。现在主要采用的化学试剂为聚乙二醇（PEG）。聚乙二醇是一种多聚化合物，常用浓度为30％～50％，随微生物种类不同而异：酵母菌原生质体融合时采用低浓度，常用浓度在20％～35％；真菌在30％左右效果较好，低于20％失去稳定性，导致原生质体破裂，高于30％会引起原生质体皱缩，过高还会产生中毒现象；链霉菌适宜浓度为0～50％。

（2）物理法——电融合和激光融合

①原生质体电融合是起始于20世纪80年代的细胞改良技术。在交流非均匀电场作用下，细胞受到电介质的作用，脉冲冲击原生质膜使其分子式打散，原生质膜在自我恢复过程中出错，造成分子重排，从而发生融合。

②激光融合是让细胞或原生质体紧密贴在一起，再用高峰值功率激光照射，击穿原生质膜，质膜在恢复过程中处于高张力状态，弯曲融合。该方法毒性小，损伤也小，但所需设备复杂昂贵，操作难度大。

5.融合子的检出

经融合再生，生成的细胞中有融合子，有杂合体等非真正意义上的重组体，这些形态的细胞都能在平板上形成菌落，还需要进一步应用确切手段进行检出鉴定。常用方法如下。

（1）利用做好的遗传标记检出融合子　该法是根据在分离的培养基上只有融合子生长而不能让双亲本原生质体生长并形成菌落。对于以营养缺陷做遗传标记的菌株来说，将混合菌直接用基本培养基就能检出融合子，因为双亲本本身是营养缺陷型，其表型表现为在基本培养基上不能生长，必须在添加了生长因子的基本培养基或完全培养基上才能生长成菌落；对以耐药性作为遗传标记的菌株来说，则需要用加有抗生素的筛选培养基平板来进行分离检出。

（2）荧光染色法检出融合子　准备双亲本时，提前使其各染上不同的荧光色素标记，然后在显微镜和荧光显微镜下，挑取同时具有两种荧光标记的细胞，转接培养即可。

在双亲本菌株中加入的荧光色素对原生质体活力无影响，携带色素的亲本原生质体能正常进行融合并再生。操作时注意，两种荧光染料的区分要明显，易分辨。

（3）利用双亲本对营养成分的要求不同检出融合子　利用亲本菌株对各种营养成分的利用差异，尤其是碳源的利用差异，结合其他特性分离筛选融合子。

6.实用性菌株的筛选

实用性菌株的筛选主要是对各种原生质体融合子的优良性状的筛选操作。其中主要包括：细菌原生质体融合子的筛选等。下面以细菌为例，来讨论融合子的筛选。

（1）原生质体的制备。选择好带有遗传标记的双亲本后，分别接种于CM斜面或平板，37℃下活化2～3代，按照2％的接种量转至空白培养液中，活化至对数期。3000r/min离心收集细胞，加入溶菌酶液进行破壁，每间隔一段时间检测破壁效果，直至生成原生质体，酶解结束。

（2）原生质体再生　将制成的原生质体调整浓度至合适，取适量（0.1～0.2mL）接种于再生平板，再加入半固体的同配方培养基覆盖、摇匀，30℃培养3天，计算再生菌落。

（3）原生质体融合　取等量两亲本原生质体悬浮液混匀，离心，收集混合细胞转入新鲜的保存液，加入40％ PEG4000，40℃下静置3min，稀释后，离心、收集细胞，接种于基本培养基上再生。

（4）融合子检出　利用前面已经讲过的检出方法进行检出。

（5）融合子鉴定　将分离得到的融合子在基本培养基上进行连续传代实验，防止互养或非融合子杂合体的干扰。如有必要，可以测定融合子的生理生化特性和宏观培养特征等指标。

（6）将确认的融合子保存。

［知识链接］

［课堂互动］

［案例分析］

［思考题］

1.叙述从自然界分离筛选菌种的主要步骤及注意事项。

2.工业菌种育种的方法有哪些？

3.什么叫诱变育种？

4.请具体介绍诱变育种的主要步骤及注意事项。

5.什么叫营养缺陷型菌株？

6.研究营养缺陷型菌株的实际意义是什么？